猪圆环病毒病病原特点与致病机理研究综述
猪圆环病毒病病原特点与致病机理研究综述
1、病毒的发现与特点
年，德国学者Tischer等首次从多株猪肾连续传代的PK-15(ATCC-CCL31)细胞中检出一种形态学上与小核糖核酸病毒类似的小球形病毒和乳多泡病毒样病毒粒子，当时认为它是一种细胞污染物，可以延续感染PK-15细胞，但不引发细胞病变。且用该分离株感染猪，未见任何临床症状和病理变化，当时被认为是一种可以感染猪的常规病毒，不会对猪造成危害。年，Tischer等进一步证实，PK-15细胞中存在的这类病毒来源于当初制备PK-15细胞的猪肾组织，因该病毒的基因组由单股环状的DNA组成，故将其命名为猪圆环病毒(porcinecircovirus，PCV)。
年，Clark发现在加拿大猪群中存在一种被称为断乳仔猪多系统衰竭综合症的新病。其临床症状主要表现为进行性消瘦、呼吸道症状、发热及黄疸等。类似的疾病相继在美国、法国、西班牙、北爱尔兰等国出现。
Lecann等报导自年始，在法国布列塔尼约个猪群中的8~13周龄猪，发生猪断奶后多系统衰弱综合征(PMWS)，感染猪表现为肌肉衰弱无力、下痢、呼吸困难，表现症状后2~8天内部份猪出现死亡，约有50%左右的猪存活，但存活猪生长发育不良。用发病猪的肺、淋巴结组织超滤液人工接种仔猪时，发现与接种猪接触的仔猪出现了临床症状，从发病猪的淋巴组织中分离病毒时，发现了PCV病毒颗粒，同时用PCR方法从发病猪淋巴组织及人工感染仔猪的鼻腔分泌物和粪便中检测到了PCV的DNA。
Segales等也报导从患PMWS病猪的淋巴组织和肺中检测到了PCV特点性核酸。Nayar等和Ellis等从含有PCV抗原和核酸的PMWS感染猪组织中分离到PCV病毒。Nayar等利用限制性内切酶酶谱进行分析发现从PMWS病例中取得的PCVDNA限制性内切酶酶型与其它来源的没有致病性的PCV限制性内切酶酶型不同。Allan等采取间接免疫荧光实验证实，从有PMWS症状猪体内分离的PCV，彼此间抗原性类似，但与传统的延续感染PK-15细胞的PCV及PCV北爱尔兰株有很大的区分。
随着与疾病相干的病毒抗原和核酸的证实，有学者推测在多个国家出现的这类病毒可能是一种新的、或是被修饰的具有致病性的猪圆环病毒。该病毒在核苷酸水平上构成了一种关系密切的种属，种内核苷酸同源性大于96%，但与PCVPK-15株的同源性唯一70%左右。根据PCV在致病性、抗原性及核苷酸序列上的差异性，他们建议将从有PMWS症状猪体内分离到的有致病性的这类PCV定为2型，而将污染猪肾传代细胞的PCVPK-15及没有致病性的这类PCV定为1型。
PCV在分类上属于圆环病毒科(Circoviridae)，圆环病毒属(Circovirus)。圆环病毒科是国际病毒分类委员会(ICTV)第六次学术报告新增病毒科，该科病毒的共同特点为病毒粒子无囊膜，基因组由一条单股、环状的DNA链组成。被列入该科的病毒既有植物病毒，又有动物病毒，其中植物病毒有地三叶草侏儒病毒(SCSV)、椰树叶腐烂病毒(CFDV)、香蕉簇顶病毒(BBTV)等；动物病毒有鸡传染性贫血病病毒(CAV)、鹦鹉喙羽病病毒(PBFDV)、猪圆环病毒(PCV)、鸽圆环病毒(CoCV)、金丝雀圆环病毒(CaCV)、人的TT病毒(TTV，一种肝炎病毒)等。
圆环病毒科内还没有具体的分属标准，Niagro等建议可将圆环病毒分为3个类群：似双病毒类嗜动物圆环病毒，包括PBFDV和PCV；似双病毒类嗜植物圆环病毒，包括SCSV、CFDV和BBTV；CAV与其它圆环病毒的结构差异较大，被列为另外一类群。现已知PCV有两个血清型，即PCV-1和PCV-2。研究认为PCV-1对猪无致病性，为非致病性病毒。PCV-2为致病性病毒，是断奶仔猪多系统衰竭综合征（PostweaningMultisystemicWastingSyndrome,PMWS)的主要病原。同时研究发现PCV-2与猪皮炎与肾病综合征（PDNS)、增生性坏死性肺炎（PNP)、猪呼吸道疾病综合征（PRDC)、繁殖障碍、先天性震颤、肠炎等疾病有重要关联。
猪圆环病毒病是由圆环病毒2型（PCV-2）引发猪的一种新的病毒病，以皮肤苍白、腹泻、呼吸困难、渐进性消瘦为特点。产生该病的病猪死亡率10%~30%不等，较严重的猪场在爆发本病时死亡率高达40%，给养猪业带来严重的经济损失。现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为是继猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）以后新发现的引发猪免疫障碍的重要传染病。
PCV是一种很小的病毒，由衣壳蛋白和基因组组成。病毒衣壳蛋白为1条多肽链，其分子量为3千道尔顿。病毒基因组是l条共价结合构成闭环状的DNA单链，DNA长约碱基对左右，分子量为0．58×道尔顿。环化的PCV2基因组具有感染性。病毒直径17纳米，呈20面体对称，沉降系数为57S，浮密度为1.36~1.37克/毫升。病毒可耐受70℃、15分钟和pH值为3的酸性环境，且核酸序列极度守旧不容易产生变异。根据致病性、抗原性和核苷酸序列，PCV可分为PCV1和PCV2两个血清型，PCV1无致病性，PCV2有致病性。PCV2毒株间核苷酸序列的同源性大于96%，PCV2与PCV1的同源性小于80%。PCV可在PK-15细胞中生长，但不能引发CPE，且需将PCV盲传多代才能使病毒有效增殖。在接种PCV的PK-15细胞培养物中加入D-氨基酸葡萄糖，可增进PCV复制，使感染PCV的细胞数量提高30%。
2、致病机理
目前的研究表明，PCV2主要在机体的单核/巨噬细胞中复制，少数可在肾小球、支气管上皮细胞、内皮细胞、肝细胞和淋巴细胞中增殖。虽然在PMWS严重发病猪体内淋巴细胞显著缺失，但几近不能或很少能从淋巴细胞中检出PCV2核酸及抗原。从定量的观点看，与其它类型的细胞相比，单核/巨噬细胞系统中PCV2的含量最多，但是PCV2核酸和抗原主要从PMWS患猪组织的巨噬细胞、树突状细胞和多核巨细胞的细胞浆中检测到，极少在细胞核中检测到。血细胞和其它上皮细胞或内皮细胞的细胞核内存在病毒标记物，表明这类细胞可能在病毒的产生进程中发挥重要作用。而单核细胞/巨噬细胞胞浆内存在的抗原和核酸是不是是其吞噬而至，和骨髓中单核细胞/巨噬细胞前身在病毒增殖中的作用，这些都需进行进一步探索。
毫无疑问，PCV2与免疫系统及其份子成分间存在相互作用，但这类相互作用在感染的初期是如何产生的，和这类相互作用是发展成为PMWS还是成为亚临床和延续感染，尚不清楚。
在PCV2感染进程中，免疫系统似乎是一把双刃剑。一方面，PCV2与其它病毒，如PRRSV和PPV同时接种实验猪时，这些病毒可以刺激和活化免疫系统，从而增进感染猪体内PCV2的增殖。因此，免疫系统的激活可能是PMWS的触发因素。
另一方面，PCV2感染也使机体产生严重的淋巴组织病变，包括淋巴细胞的缺失及淋巴组织免疫细胞亚群的变化，这就使机体的免疫力下落，从而对其它病原不能产生有效的免疫应对，也是该病产生机理的重要部份。
2.1免疫刺激
目前已证实，PCV2可引发猪产生PMWS。PCV2感染可能是引发PMWS的主要原因，但不是唯一的缘由，有些PMWS病例还有PPV，PRRSV等的共同感染。
Allan等研究表明，用PCV2单独感染或PCV2与PPV混合感染未吃初乳的仔猪，可使猪表现PMWS临床症状及病理变化，混合感染较PCV2单独感染严重，可引发实验猪死亡，而单独感染PPV的实验猪不表现任何临床症状和病理变化。
Allan等认为PCV2与PPV对猪都具有较强的感染性，在自然界中都广泛存在，因此，二者混合感染引发PMWS的可能性较大。Ellis等将PMWS患猪的组织病料及其细胞分离物接种限菌仔猪，接种物中起初被证明只含有PCV2，但从复制出的PMWS猪的组织病料中却分离出了PCV2及PPV，只不过PPV的含量较少，对此研究结果，Ellis等认为PMWS是PCV2与PPV混合感染的结果，过去所报导的一些PMWS病例中，之所以只分离到PCV2而没有发现PPV，可能是由于PPV在患猪组织中的含量较少，同时PPV对PK-15细胞也不太敏感而至。由于这两种病毒都可以感染巨噬细胞，并且其复制都需要细胞周期的S期表达的细胞酶类，有可能是PPV在感染巨噬细胞时使巨噬细胞活化，从而增进PCV2的复制，一样，也可能是其它未知因素增进了这两种病毒的复制。对PCV2与PPV的这类协同作用机理尚不清楚。类似的问题在PCV2与PRRSV中也存在，由于PRRSV也在巨噬细胞中复制。PRRSV感染是世界性的普遍问题，而且PCV2和PRRSV共感染的发生率在PMWS，PDNS及PRDC中很高。
如果PPV和PRRSV刺激了免疫系统并且增进了PCV2的复制，可以假定，其它非传染性刺激原与PCV2共同作用一样可以加重PMWS症状及病变。
Krakowka等将PCV2感染新生仔猪后，再注射弗氏不完全佐剂乳化的钥孔戚血蓝蛋白(KLH/ICFA)，可使PCV2感染仔猪出现明显的PMWS症状及病变，而未注射KLH/ICFA组则未产生PMWS。因此，免疫刺激在PMWS的病发进程中可能起着关键性的作用。这一点对实际生产有很大的指点作用。
在希腊进行的田间试验证明疫苗免疫或非特异性免疫调节剂可以影响PCV2自然感染猪的PMWS症状及病变。该研究是从PMWS爆发期间的某猪场选择84头临床健康猪，分为3组，每组28头，第1组在7日龄和28日龄分别接种猪支原体肺炎疫苗，在42日龄肌肉注射PBS；第2组在7日龄肌肉注射PBS，而在28日龄和42日龄注射非特异性免疫调节剂；第3组在7，28和42日龄分别注射PBS，作为对比组。结果在接种猪支原体肺炎疫苗组有42.9%的猪产生了典型的PMWS临床症状，在注射免疫调节剂组有50%的猪产生PMWS，而对比组只有10.7%的猪产生PMWS。因此，我们可以得出结论，通过注射疫苗或免疫调节剂等非特异性刺激免疫系统，可以增进PCV2的复制，在PMWS爆发期间可以加重PMWS临床症状。
2.2免疫抑制
PCV2感染引发机体的免疫抑制，也是其致病机理的重要部份。在PMWS研究中，有许多研究结果都对该病的免疫抑制特点进行了描写，主要表现为：对抗生素医治无效；同窝效应的存在；其它疾病综合征的同时存在；通常被认为是无致病性病原体的感染，这些都与免疫缺点病的特点符合。McNeilly等研究了PCV感染对猪肺巨噬细胞体外免疫功能的影响，结果发现，从全部感染进程来看，PCV感染对抗体Fc段及补体受体的表达或对巨噬细胞的吞噬作用及其辅助杀伤作用均无任何影响。在此研究中，作者所用的PCV病毒是来自延续感染该病毒的猪肾传代细胞，经过屡次传代后病毒的毒力可能减弱，因此，PCV感染对猪肺巨噬细胞免疫功能无影响，有可能是由于病毒的毒力减弱而至，也可能是由于PCV本身就对猪肺巨噬细胞免疫功能无影响造成。但作者也观察到PCV感染对巨噬细胞有短暂性的影响，PCV感染后2天可明显的抑制巨噬细胞介导的、分裂素引诱的淋巴细胞增殖，PCV感染后4天可增加细胞MHC-Ⅰ类抗原的表达量，但表达MHC-Ⅰ类抗原的细胞总量与对比组相比无差别，此时，MHC-Ⅱ类抗原的表达量不变，而在感染后8天可下降细胞MHC-Ⅱ类抗原的表达。现有的研究表明，MHC-Ⅰ类抗原及MHC-Ⅱ类抗原表达量的下降可能与病毒感染细胞时病毒介导的细胞膜的凹陷及病毒从细胞浆内向复制中心的移动有关。
Segales等用流式细胞仪对自然感染PCV2猪外周血单核细胞进行研究发现，患猪外周血单核细胞数量较正常对比组明显增多，且出现少许未成熟粒细胞，而T淋巴细胞(主要CD4﹢和B淋巴细胞)数量下落，说明急性感染PCV2患猪不能产生有效的免疫应对。但Darwich等对PCV2阳性和阴性的消瘦猪群的外周血单核细胞同时用流式细胞仪进行检测发现，所有消瘦猪无论是PCV2阳性还是PCV2阴性猪，其CD4﹢细胞都下调，这可能暗示CD4﹢细胞下调与猪的消瘦相干。而对外周血T细胞亚群的研究发现，外周血中CD8﹢T细胞和CD4﹢CD8﹢T细胞数量下落仅见于PCV2感染猪，这表明CD8﹢T细胞和CD4﹢CD8﹢T细胞变化与PMWS发展过程有关。CD8﹢T细胞的主要作用是参与细胞毒性反应，因此，应对PMWS感染猪的一般细胞毒性反应和病毒特异性的细胞毒性反应进行进一步研究。CD4﹢CD8﹢T细胞是成熟的淋巴细胞，其主要功能是起记忆细胞和效应细胞的作用。因此，CD4﹢CD8﹢T细胞的变化可能干扰机体的免疫记忆反应。关于PCV2感染猪外周血中IgM﹢细胞的变化也有报导。
Shibahara等认为IgM﹢细胞减少可能是致使PCV2感染猪的B淋巴细胞产生凋亡的缘由。Darwich等研究表明，根据外周血中IgM﹢细胞水平的不同，可以将PCV2阳性猪分为两类：一类是IgM﹢细胞比例5%的猪，另外一类是IgM﹢细胞比例5%的猪。经分析已证实，5%临界值与感染猪组织中PCV2的含量及病变的严重程度有很大关系，因此，可以将5%的IgM﹢细胞比例作为评价PCV2感染严重性的指标。另外，淋巴组织中PCV2数量与这些组织的细胞衰竭程度呈正相干，而与外周血中IgM﹢和CD8﹢细胞数量呈负相干，这一样说明PCV2感染下降了患猪的免疫应对。通过免疫组化研究发现，患PMWS猪的腹股沟淋巴结变化分三个阶段，早期和中期阶段淋巴细胞萎缩，淋巴细胞减少，滤泡间树突状细胞数量减少，B细胞和CD4﹢T细胞减少或缺失；后期淋巴结基质成分出现；同时还发现PCV2引发抗原提呈细胞的提呈能力下落，B细胞和CD4﹢T细胞功能减弱。在细胞因子的产生方面，Sipos等对PMWS感染猪的细胞因子mRNA及蛋白质水平进行的研究表明，感染猪的IL-1a及IL-10的表达量增加，这一点与Darwich等的研究结果相一致，之前的研究表明，IL-10mRNA表达水平升高仅产生在胸腺和扁桃体，但Sipos等发现，感染猪的外周淋巴细胞中IL-10表达水平也很高，这表明IL-10的过量表达不但局限于胸腺，它也可能是免疫反应向对机体不利的方向发展所必须；IL-10及IL-6在蛋白质水平上的增加可以为单核/巨噬细胞系统的激活提供根据；在mRNA水平上，IL-8及TNF-a微量升高，而这两种细胞因子与炎性反应的产生有关；在mRNA水平上，IL-2显著下降，而在蛋白质水平上，IL-2表达量增加，从这一点可以看出，细胞内细胞因子的检测结果可以反应其它细胞的功能，即虽然细胞内的IL-2mRNA转录水平很低，但在其它细胞的作用下促使更多的淋巴细胞产生IL-2，从而使IL-2的表达量升高；在蛋白质水平上，IFN-γ表达量下降，而在mRNA水平上，IFN-γ微量升高，说明产生Thl型保护性免疫反应的能力下降，这与Nielsen等的研究结果符合；IL-4可以增进细胞介导的Th2型免疫反应，感染猪IL-4表达量下降可能暗示特异性体液免疫水平的下降。Shibahara等研究发现PCV感染在淋巴器官引发的特点性组织学病变是：淋巴细胞缺失、巨噬细胞增多及出现细胞浆内包涵体，这一点与之前的报导相同。另外，在这些组织常发生B淋巴细胞凋亡，更为重要的是，作者发现PCV抗原和病毒粒子被限制在巨噬细胞吞噬的凋亡小体中，并且凋亡小体中无其它病原微生物存在。这些结果表明PCV可引诱B淋巴细胞凋亡并致使B淋巴细胞缺失和猪的免疫抑制。
结合之前的研究结果Shibahara等推测，PCV感染引发猪免疫抑制的致病机理：
PCV直接感染分裂期细胞，包括B细胞和巨噬细胞，并通过细胞间传播直接引发单个B细胞凋亡，不能引诱巨噬细胞凋亡或坏死。含PCV的淋巴细胞凋亡小体在生发中心被巨噬细胞和巨细胞吞噬作为一种传染源感染其它细胞或通过淋巴结转移，这个进程在全部感染期都存在，乃至在感染初期及无症状期也存在。巨噬细胞吞噬凋亡细胞后，凋亡小体中的病毒粒子可自发地转染巨噬细胞，致使新的病毒粒子的产生。
淋巴器官中大量B细胞凋亡可能是PCV致病机制之一，并且也可以用来解释PCV感染猪后B细胞为什么会剧烈减少。大量B细胞凋亡使机体的免疫力下落，继而造成其它病原，如PPV、PRRSV的继发感染，从而使PCV感染猪出现更严重的临床症状。
PCV与可以引发免疫抑制的鸡传染性贫血病病毒(CAV)属于同一个病毒家族。对CAV的研究已证实，它可以编码一种凋亡素蛋白，这类蛋白可引诱人的各种肿瘤细胞产生凋亡，但不能使正常细胞产生凋亡。据此，Shibahara等推测PCV可能编码一种类似凋亡素的物资从而引诱B淋巴细胞凋亡，对此推测尚需进一步证实。
Rosell等从2个PMWS慢性病例中发现，PCV2从猪的鼻、口腔侵入体内，在扁桃体和局部淋巴结增殖后，向其它淋巴组织、肺、肝和肾散布，受慢性感染的影响，引发免疫抑制、肠炎、间质性肾炎及肝脏损伤。
Hirai等对试验性感染PCV2而产生急性感染的仔猪进行研究发现，仔猪肝脏的病变特点表现为肝小叶中心坏死、肝板破坏、枯否氏细胞增生及肝窦状隙中巨噬细胞增加。肝细胞常肿胀，有时在其核内存在嗜红细胞的细胞核内包涵体。在肝细胞、枯否氏细胞的胞浆中常见小颗粒状的嗜碱性到嗜中性包涵体。在肝细胞、枯否氏细胞及浸润的巨噬细胞中存在大量PCV2抗原和核酸，在肝细胞中，PCV2抗原和核酸主要位于其细胞核内，在核周围也零星存在，而在枯否氏细胞及浸润的巨噬细胞中，PCV2抗原和核酸主要位于细胞浆内，而细胞核中很少。在肝细胞、枯否氏细胞及浸润的巨噬细胞胞核内不存在病毒粒子。肝细胞的细胞核及一些凋亡小体表现TUNEL染色阳性，并且这些TUNEL染色阳性的肝细胞主要位于肝小叶坏死区域及其周围。电镜视察结果显示，胞浆内包涵体主要分散在退化的或无核的坏死肝细胞及巨噬细胞中，并且在包涵体中含有直径约为17nm的无囊膜的呈晶格状排列的病毒粒子。产生凋亡的肝细胞其染色质固缩，并有核膜包围。因此，作者推测细胞凋亡可能参与了肝脏病变的产生。
Allan等则认为PMWS极可能是PCV2和猪小核糖核酸病毒共同作用的结果。猪小核糖核酸病毒在猪的免疫细胞中复制，所以极可能引发免疫抑制，增进PCV2的复制。或猪小核糖核酸病毒活化了作为PCV2靶细胞的单核巨噬细胞类细胞，增进了靶细胞对PCV2的感受性。从以上研究结果可见，PCV2对机体的影响表现在三个方面：PCV2本身的致病性；其它免疫刺激因子对免疫系统的刺激，增进了PCV2的复制而使机体病情加重；PCV2对机体免疫系统的影响，使机体的免疫抵抗力下落，造成其它病原的继发感染，从而引发更加严重的临床症状。
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